SEM

SEMによる表面構造解析

走査電子顕微鏡（SEM）は、試料表面の微細構造を高分解能で観察するための代表的な電子顕微鏡法です。当研究室では、植物組織、微生物、培養細胞、昆虫、菌類、土壌粒子を含む複合試料など、さまざまな生物試料を対象に、SEMによる表面構造解析を行っています。

SEMで細胞や組織の表面を観察する場合、試料の種類、含水状態、観察目的、使用する電子顕微鏡の性能に応じて、固定、洗浄、観察面の剖出、脱水、乾燥、載台、導電処理などを組み合わせて試料作製を行います。乾燥した試料や硬い試料では、比較的少ない前処理で観察できる場合がありますが、水分を多く含む生物試料では、真空中で形態を保つための適切な前処理が重要になります。

生物試料のSEM観察では、まず組織や細胞の形態をできるだけ生体に近い状態で保持するために固定を行います。固定法は透過電子顕微鏡（TEM）試料作製の基本と共通する部分が多く、一般的にはグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドなどのアルデヒド系固定剤による前固定と、四酸化オスミウムなどの重金属系固定剤による後固定を組み合わせます。これにより、タンパク質や脂質を安定化し、細胞表面や細胞間構造の変形を抑えます。

SEMの観察室は通常、真空状態であるため、水分を含む試料は乾燥させる必要があります。しかし、生物試料をそのまま大気中で乾燥させると、水の表面張力によって細胞や組織の微細構造が収縮・変形することがあります。そのため、エタノール系列などを用いて段階的に脱水した後、t-ブチルアルコール凍結乾燥法や臨界点乾燥法などを用いて、できるだけ形態を保ったまま乾燥します。植物の表皮、気孔、毛状突起、花粉、菌糸、微生物集合体などの観察では、この乾燥過程の条件設定が観察像の品質に大きく影響します。

乾燥後の試料は、SEM用試料台に固定します。この工程を載台と呼びます。載台では、試料が観察中に動かないように固定するだけでなく、電子線照射時の帯電を抑えるために、導電性両面テープ、カーボンテープ、導電ペーストなどを用います。生物試料の多くは導電性が低いため、電子線を照射すると試料表面に電子が蓄積し、像の歪み、異常な明暗、ドリフト、観察不能などの原因になります。この現象を帯電、またはチャージアップと呼びます。

帯電を抑えるためには、試料表面に金属やカーボンの薄膜を形成する導電処理を行います。代表的な方法には、オスミウムコーティング、白金・金・金パラジウムなどのイオンスパッタ、カーボンコーティングがあります。特にオスミウムコーティングは、1〜2 nm程度の非常に薄い膜を比較的均一に形成でき、複雑な表面構造を持つ生物試料でも微細構造を保ったまま導電性を付与しやすいため、FE-SEMを用いた高分解能観察に適しています。

一方で、近年のSEMでは、試料作製法や観察モードの選択肢が広がっています。低真空SEMや環境制御型SEMを用いることで、非導電性試料や軽度に水分を含む試料を、金属コーティングなしで観察できる場合があります。また、クライオSEMでは、試料を急速凍結し、低温状態を保ったまま観察することで、乾燥による変形を避け、含水状態に近い表面構造を解析することができます。これらの方法は、従来の化学固定・脱水・乾燥法では失われやすい柔らかい構造や、水分を含む界面構造の観察に有効です。

さらに当研究室では、表面観察に加えて、断面研磨SEM法やCLEM（光-電子相関顕微鏡法）などの技術も組み合わせています。表面構造をSEMで詳細に観察するだけでなく、必要に応じて試料内部の構造、光学顕微鏡像との対応、広域の組織構築との関係を解析することで、生物試料の形態情報を多角的に捉えることを目指しています。

SEM試料作製は基礎的な技術ですが、観察対象によって最適な条件は大きく異なります。固定液の種類、脱水条件、乾燥法、導電処理、加速電圧、検出器の選択などを適切に組み合わせることで、試料本来の表面構造をより正確に観察することができます。当研究室では、これまでの共同研究で蓄積してきた経験をもとに、目的に応じたSEM試料作製と観察条件の最適化を行っています。

→ 走査電子顕微鏡サンプル作製 〜表面観察／植物組織・細胞〜（PDF）

→ 走査電子顕微鏡 第2版
鈴木智子, 佐藤繭子, 豊岡公徳 (担当:分担執筆, 範囲:5.4 植物の観察)
公益社団法人 日本表面真空学会 編集 2025年12月 (ISBN: 9784621312278)

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