Immunogold labeling

免疫電子顕微鏡法による分子局在解析

免疫電子顕微鏡法（免疫電顕法）は、抗原抗体反応を利用して、目的タンパク質や特定分子の局在を電子顕微鏡下で検出する方法です。抗体に結合した金コロイド粒子などの電子密度の高い標識を用いることで、細胞内のどの構造に目的分子が存在するのかを、ナノメートルスケールで解析することができます。

近年、蛍光タンパク質や蛍光抗体染色を用いたライブイメージング、共焦点レーザー顕微鏡、超解像顕微鏡などの技術が大きく発展し、細胞内分子の可視化は非常に容易になりました。しかし、蛍光顕微鏡では分解能や細胞内微細構造との対応に限界がある場合があります。免疫電顕法は、目的分子の局在を細胞膜、細胞小器官、輸送小胞、液胞、細胞壁、分泌構造などの超微細構造上で直接確認できるため、分子局在を証明する強力な手法です。

免疫電顕法では、通常の構造観察とは異なり、抗原性を保持するための試料作製条件が重要になります。四酸化オスミウムによる後固定は膜構造の保存やコントラスト向上に有効ですが、抗原性を低下させることが多いため、免疫電顕ではアルデヒド系固定剤のみを用いる場合が多くあります。また、エポキシ系樹脂では抗体が反応しにくくなることがあるため、LR WhiteやLowicryl HM20などのアクリル系樹脂を用いて包埋します。

樹脂包埋後、ウルトラミクロトームを用いて超薄切片を作製し、ニッケルメッシュグリッド上に回収します。その後、切片上で一次抗体を反応させ、さらに金コロイド標識二次抗体を反応させます。目的抗原が存在する部位には金コロイド粒子が結合し、透過電子顕微鏡（TEM）で観察すると、電子密度の高い黒い粒子として検出されます。必要に応じて電子染色を行うことで、細胞内構造と金コロイド標識の位置関係を同時に解析します。

免疫電顕法では、抗体の特異性、固定条件、樹脂の種類、切片上での抗体反応条件、ブロッキング条件、金コロイド粒子径、電子染色条件などが結果に大きく影響します。そのため、目的タンパク質や試料に応じた条件検討が不可欠です。当研究室では、植物細胞や生物試料を対象に、免疫電顕法を用いたタンパク質局在解析を行ってきました。

また、蛍光顕微鏡による局在観察と免疫電顕法を組み合わせることで、蛍光シグナルで捉えた分子局在を、電子顕微鏡レベルの細胞内構造に対応づけることができます。このような光-電子相関解析は、タンパク質の局在をより高い信頼性で示すために有効です。

## 関連資料

詳細については、以下の総説をご覧ください。

- 佐藤 繭子, 後藤 友美, 豊岡 公徳「植物の免疫電子顕微鏡法」2017 年 52 巻 2 号 p. 98-103

- 関連プロトコル

免疫電子顕微鏡法の応用例

当研究室では、免疫電顕法を用いて、植物細胞内におけるさまざまなタンパク質の局在を明らかにしてきました。

### ミラクルフルーツにおけるミラクリンの局在
筑波大学 江面研究室との共同研究

ミラクルフルーツに含まれる味覚修飾タンパク質ミラクリンについて、果実細胞内での蓄積部位を免疫電顕法により解析しました。金コロイド標識により、ミラクリンが細胞内のどの構造に局在するかを超微細構造レベルで明らかにしました。

Hirai et al. J. Plant Physiol. 2010.


### アズキ子葉細胞におけるシステインプロテアーゼの局在
豊岡の学生時代の研究

アズキ種子の子葉細胞において、貯蔵タンパク質の分解に関わるシステインプロテアーゼの細胞内局在を免疫電顕法により解析しました。貯蔵組織におけるタンパク質分解過程を、細胞内構造との関係から明らかにしました。

Toyooka et al. J. Cell Biol. 2000.


### インゲン豆老化葉におけるルビスコの局在
豊岡の学生時代の研究

インゲン豆の老化葉を用いて、葉緑体内に存在する主要な光合成酵素Rubiscoの局在を免疫電顕法により解析しました。葉の老化過程における葉緑体タンパク質の挙動を、超微細構造レベルで観察しました。

Minamikawa et al. Protoplasma 2001.


### 分泌に関わる4回膜貫通タンパク質SCAMP2の局在
理研／九州大学 松岡研究室との共同研究

植物細胞における分泌経路に関わる4回膜貫通タンパク質SCAMP2について、免疫電顕法を用いて細胞内局在を解析しました。SCAMP2が細胞内膜系のどの区画に存在するかを明らかにし、植物細胞の分泌・膜交通機構の理解に貢献しました。

Toyooka et al. Plant Cell 21, 1212–1229, 2009.


### ニコチントランスポーターMATEの局在
奈良先端科学技術大学院大学 橋本研究室との共同研究

ニコチン輸送に関わるMATE型トランスポーターについて、植物細胞内での局在を免疫電顕法により解析しました。トランスポーターの局在を細胞内膜系と対応づけることで、ニコチン輸送機構の理解に貢献しました。

Shoji et al. Plant Physiol. 149, 708–718, 2009.


### オートファジー関連タンパク質ATG8の局在
明治大学 吉本研究室との共同研究

オートファジーに関わるATG8タンパク質について、免疫電顕法により細胞内局在を解析しました。オートファジー関連構造とATG8の位置関係を電子顕微鏡レベルで明らかにし、植物細胞における分解系の理解に貢献しました。

Yoshimoto et al. J. Cell Sci. 127, 1161–1168, 2014.

ほか。