Imaging MS

凍結切片作製と質量イメージング

植物組織に含まれる代謝物や低分子化合物は、組織や細胞の種類、発生段階、環境応答に応じて不均一に分布しています。そのため、植物の機能を理解するためには、どの化合物が、どの組織・細胞に、どのように蓄積しているのかを空間情報とともに解析することが重要です。

質量イメージング法、またはイメージング質量分析（imaging mass spectrometry; IMS）は、組織切片上の各位置から質量分析データを取得し、特定の質量電荷比（m/z）を持つ分子の分布を画像として可視化する技術です。植物組織内における低分子代謝物、二次代謝産物、脂質、薬用成分などの局在を、標識なしで解析できる点が大きな特徴です。

一方で、植物試料を対象とした質量イメージングでは、高品質な凍結切片を作製することが重要な課題となります。植物組織は細胞壁に囲まれており、組織によって硬さや含水量が大きく異なります。また、葉、根、種子、茎、花、薬用植物組織などでは、空隙、硬い組織、柔らかい組織が混在するため、動物組織で一般的に用いられる凍結切片作製法をそのまま適用することが難しい場合があります。

近年、川本法に代表される凍結試料接着テープを用いた切片回収法が発展し、硬い組織や崩れやすい組織を含む植物試料でも、形態を保った凍結切片を作製できるようになってきました。当研究室では、高性能クライオスタットを用いて植物試料の凍結切片作製条件を検討し、組織構造を保持した切片を安定して作製するための技術開発を進めてきました。

この凍結切片作製技術は、レーザーマイクロダイセクション（laser microdissection; LMD）にも応用できます。LMDでは、組織切片上の目的領域や特定の細胞群をレーザーで切り出し、RNAやDNA、代謝物などを回収して解析します。当研究室では、植物組織を対象に、LMDを用いたトランスクリプトーム解析に適した組織・細胞の探索、高品質RNAを回収するための固定条件、凍結切片作製条件の検討を行ってきました。

さらに、凍結切片を質量イメージングに用いることで、低分子化合物や植物二次代謝産物の組織内分布を可視化する方法の検討を進めてきました。質量イメージングでは、組織切片の形態保持、切片厚、乾燥条件、マトリックス塗布、測定条件などが、検出感度や空間分解能に大きく影響します。そのため、顕微鏡解析で培った切片作製技術と、質量分析技術を組み合わせることが重要になります。

当ユニットでは、超高分解能質量分析装置を用いたイメージング質量分析の分析基盤を確立し、植物組織内における含窒素代謝物の蓄積分布を可視化しました。この研究では、超高分解能LC-MS、高分解能MALDI-MS、高分解能IMSを組み合わせたN-omicsプラットフォームが開発され、植物に含まれる多様な窒素含有代謝物の解析に展開されました。

また、薬用資源として重要なモノテルペンインドールアルカロイドを標的としたメタボローム解析手法の開発にも取り組みました。薬用植物ニチニチソウを用いた解析により、モノテルペンインドールアルカロイドの探索、組成・構造の推定、組織内での蓄積分布の可視化が可能になりました。

近年は、質量イメージングを用いて、代謝物の空間分布を解析する「空間メタボロミクス」への関心が高まっています。特に植物では、根、葉、種子、花、分泌組織、根圏などにおける代謝物の局在を明らかにすることで、発生、環境応答、微生物相互作用、薬用成分生産などの理解につながります。当研究室では、凍結切片作製、顕微鏡観察、レーザーマイクロダイセクション、質量イメージングを組み合わせ、植物組織における分子分布を空間的に解析する技術開発を進めています。